Функциональные и фенотипические особенности NK- и Т-регуляторных клеток при раке молочной железы

СОДЕРЖАНИЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 4
ВВЕДЕНИЕ 7
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………..12
1.1 Т-регуляторные клетки и их роль в иммунной системе ………………12
1.1.1 Общие положения о Т-регуляторных клетках ……………………12
1.1.2 Естественные Т-регуляторные клетки ………………………17
1.1.3 Индуцированные Т-регуляторные клетки……………….. 29
1.2 Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных клеток……38
1.2.1 Натуральные киллерные клетки ………………….38
1.2.2 Иммунорегуляторные функции натуральных киллерных клеток …………..42
1.2.3 Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных клеток…..45
1.3 NK- и Т-регуляторные клетки при раке молочной железы …………….48
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………….54
2.1 Материалы исследования ……………54
2.1.1 Исследуемый материал …………….54
2.1.2 Реагенты и материалы …………..54
2.1.3 Оборудование ……………55
2.2 Методы исследования ……………..56
2.2.1 Приготовление перколла ……………56
2.2.2 Приготовление полной культуральной среды …………….56
2.2.3 Культивирование клеток ……………56
2.2.4 Выделение клеток ………………….57
2.2.5 Оценка супрессорной активности субпопуляций Treg-клеток …..58
2.2.6 Оценка супрессорной активности HLA-G+ NK-клеток ………….58
2.2.7 Проточная цитофлуориметрия ………….59
2.2.8 ELISPOT анализ ……………60
2.2.9 ПЦР анализ………….. 60
2.2.10 Статистическая обработка данных …………..60
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ………………61
3.1 Изучение Т-регуляторных клеток в норме и при раке молочной железы….61
3.1.1 Анализ естественных Т-регуляторных клеток здоровых доноров и больных раком молочной железы …………………61
3.1.2 Tr1-, Th3- и Treg-17-клетки в норме и при раке молочной железы ……….68
3.1.3 Изучение CD3+HLA-G+ регуляторной популяции клеток периферической крови здоровых доноров и больных РМЖ …………….79
3.1.4 Изучение гиалуронан-связывающих и -несвязывающих T-регуляторных клеток здоровых доноров и больных раком молочной железы …………………83
3.2 Изучение регуляторных субпопуляций NK-клеток в норме и при раке молочной железы ……………97
3.2.1 Изучение экспрессии IL-10 и TGF-β NK-клетками здоровых доноров и больных РМЖ …………………97
3.2.2 Изучение HLA-G+ NK-клеток здоровых доноров и больных РМЖ ………106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………120
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


ВВЕДЕНИЕ
Поддержание иммунного гомеостаза обеспечивает защиту организма от различных проявлений биологической агрессии, как экзогенного, так и эндогенного характера. Данную функцию выполняет комплекс иммунной регуляторной системы, к которой относится сеть иммунорегуляторных клеток. В мировой литературе в последнее время активно обсуждается вопрос о роли иммунорегуляторных клеток в развитии патологических состояний, таких как онкологические и аутоиммунные заболевания, аллергия, нарушение нормального течения беременности и невынашивание плода и т.д.
Согласно современной парадигме, ускользание опухоли от иммунного надзора и несостоятельность иммунного ответа при раке обусловлены различными механизмами, обеспечивающими общий иммуносупрессорный фон в опухолевом микроокружении. В последнее время стало ясным, что опухолевые клетки сами способны создавать толерогенное микроокружение и использовать иммуносупрессорные механизмы для защиты от иммуного ответа. В этом же контексте в последние годы активно обсуждается роль регуляторных клеток, обладающих супрессорной активностью [1].
Одним из основных звеньев супрессорного пула иммуноцитов являются Т- регуляторные клетки (Treg-клетки). Treg-клетки играют одну из ключевых регулирующих ролей в иммуной системе и аккумулирование таких клеток в опухолевом микроокружение вносит значительный вклад в подавление противоопухолевого иммунного ответа. Согласно результатам многих исследований у пациентов со злокачественными новообразованиями, в том числе и у больных раком молочной железы (РМЖ), содержание CD4+CD25+Foxp3+-лимфоцитов увеличено как в периферической крови, так и в опухолевой ткани [2]. Инфильтрация Treg-клеток опухоли и количество данных клеток практически при всех типах рака и при РМЖ коррелирует со стадией заболевания и низкой выживаемостью пациентов, что может указывать на важное прогностическое значение этих ……………………………


Целью данного исследования является изучение функциональных и фенотипических характеристик субпопуляций NK- и T-регуляторных клеток ПК больных раком молочной железы, как потенциальных маркеров подавления противоопухолевого иммунитета.
Объект исследования — NK- и Т-регуляторные клетки ПК здоровых и больных раком молочной железы женщин, предметом исследования являются функциональные и фенотипические характеристики данных клеток.
Исходя из цели исследования, решались следующие задачи:
1. Изучить особенности субпопуляций nTreg- и iTreg-клеток ПК здоровых доноров и больных РМЖ;
2. Провести анализ содержания и продукции супрессорных цитокинов HLA-G-экспрессирующими Т-клетками в ПК здоровых доноров и больных РМЖ;
3. Изучить функциональные и фенотипические характеристики НА-связывающей субпопуляции Treg-клеток в ПК здоровых доноров и больных РМЖ;
4. Провести сравнительный анализ содержания и ……………………………………….


ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Регуляция иммунного ответа имеет большое значение для достижения нужного уровня специфичности и иммунной памяти, включения именно тех эффекторных механизмов, которые бы наилучшим образом отвечали потребностям организма, а также для исключения нежелательных последствий гиперактивации иммунной системы. Изучение иммунорегуляторных клеток важно для раскрытия механизмов поддержания гомеостаза и развития многих заболеваний. Настоящее исследование было посвящено изучению NK- и Т- регуляторных клеток, как важнейших участников иммунного ответа. В результате исследований были получены следующие основные результаты: ………………………..


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Gabrilovich D.I. Tumor-Induced Immune Suppression. Mechanisms and Therapeutic Reversal / под ред. Hurwitz A.A. – Springer, 2014. – 464 р.
2 Liyanage U.K., Moore T.T., Joo H.G., Tanaka Y., Herrmann V., Doherty G., Drebin J.A., Strasberg S.M., Eberlein T.J., Goedegebuure P.S., Linehan D.C. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumour microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169. – P. 2756–2761.
3 Sutmuller R.P., van Duivenvoorde L.M., van Elsas A., Schumacher T.N., Wildenberg M.E., Allison J.P., Toes R.E., Offringa R., Melief C.J. Synergism of
cytotoxicT lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25(+) regulatoryTcells in anti tumor therapy reveals ……………………………..

download